ICS 65.020 CCS B 05 榆 DB6108 林 市 地 方 标 准 DB6108/T 20.4—2021 羊肚菌标准综合体 第 4 部分：液体菌种生产技术规 程 2021 - 03 -31 发布 榆林市市场监督管理局 2021 - 04 - 01 实施 发布 DB6108/T 20.4—2021 目 次 前言 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . .II 1 范围 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . .1 2 规范性引用文件 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . .1 3 术语和定义 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . .1 4 基本要求 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . .1 5 液体菌种生产 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . .. . . . . . .2 6 液体菌种的使用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . .4 7 记录与存档 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . .4 附录 A（规范性附录）羊肚菌液体菌种生产记录表 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5 DB6108/T 20.4—2021 前  言 本文件按照 GB/T1.1-2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 《羊肚菌标准综合体》 分为 7 个部分： ——第 1 部分： 生产环境； ——第 2 部分： 菌种； ——第 3 部分： 菌种生产技术规程； ——第 4 部分： 液体菌种生产技术规程； ——第 5 部分： 设施栽培技术规程； ——第 6 部分： 产品分级与加工； ——第 7 部分： 病虫害防控技术规程。 本文件为《羊肚菌标准综合体》的第 4 部分。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由榆林市农垦服务中心提出。 本文件由榆林市农业农村局归口。 本文件起草单位：榆林市农垦服务中心、榆林市马合农场。 本文件主要起草人：郝哲、张彦飞、雷萍、杜双田、赵琪、张锋、薛浩、景仰平、霍冬霞、朱砚沉、 梁海燕、李红、李惠霞、高悦、思瑞琳、薛舒尹、张宏静。 本文件由榆林市农垦服务中心负责解释。 本文件首次发布。 联系信息如下： 单位：榆林市农垦服务中心 电话：0912-3645472 地址：榆林市榆阳区保宁西路广德巷 1 号 邮编：719000 II DB6108/T 20.4—2021 羊肚菌标准综合体 第 4 部分：液体菌种生产技术规程 1 范围 本文件规定了羊肚菌液体菌种生产的术语和定义、基本要求、液体菌种生产、液体菌种的使用、记 录与存档的技术要求。 本文件适用于榆林及同类地区羊肚菌液体菌种的生产。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 5749 生活饮用水卫生标准 GB 50073 洁净厂房设计规范 GB/T 150.4 压力容器 第 4 部分：制造、检验和验收 GB/T 12728 食用菌术语 NY 5099 无公害食品 食用菌栽培基质安全技术要求 NY/T 528 食用菌菌种生产技术规程 3 术语和定义 GB/T 12728 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 液体菌种 liquid spawn 装有液体培养基的容器中，通过控制温度、不断振荡或通气搅拌，使羊肚菌菌丝短期内在液体中繁 育并获得的大量菌丝体片段或菌丝球。 3.2 液体菌种发酵罐 liquid strain fermenter 进行食用菌液体菌种培养的专用发酵设备。 3.3 液体菌种接种器 liquid strain inoculator 将液体菌种按无菌操作要求接种到固体培养基物料上的工具。 4 基本要求 4.1 人员要求 具有食用菌菌种生产或检验人员从业资格证或经验丰富的专业技术人员。技术人员应保持个人卫 生，进入液体菌种生产车间须穿戴经灭菌处理的工作服、鞋、帽、口罩。 1 DB6108/T 20.4—2021 4.2 场所要求 生产场所要求符合 GB 50073 和 NY/T 528 相关规定。生产车间地面应防水、防腐蚀、防渗漏、防 滑，易清洗，有 1.0°～1.5°的排水坡度和良好的排水系统；墙壁和天花板应具有防潮、防霉、防水 功能，且易清洗；水源的电力满足生产要求，水源符合 GB 5749 相关规定，通风良好。 4.3 设施设备 配料室、培养室、检测室等设施规模要配套，布局合理，有控温设备。磅秤、天平、高压蒸汽灭菌 锅、液体菌种发酵罐、液体菌种接种器、超净工作台、接种箱（室）、恒温摇床或磁力搅拌器等常规用 具齐全。压力容器应经政府有关部门检验合格，符合 GB/T 150.4 相关规定。 4.4 培养基质 符合 NY 5099 相关规定。 5 液体菌种生产 5.1 工艺流程 液体菌种生产的工艺流程图见图 1。 母种 培养基配制 灭菌 发酵罐空消 基质准备 投料 接种培养和检测 灭菌 发酵罐接种 培养与检测 发酵罐菌种 培养基配 图1 5.2 摇瓶液体菌种 液体菌种生产工艺流程 摇瓶液体菌种生产 5.2.1 容器 使用无色或近无色专用三角瓶，可用棉塞（梳棉或化纤棉）、硅胶塞、专用封口透气膜封口。 5.2.2 培养基配方 马铃薯 200g、麦麸 50g、葡萄糖 20g、磷酸二氢钾 2g、硫酸镁 0.5g、VB10.5mg、加水至 1000mL。 5.2.3 培养基配制 按液体培养基配方配制，马铃薯和麦麸煮汁过滤后，加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、VB1，加 水至 1000mL 搅拌均匀，装入摇瓶，装液量为摇甁容量的 2/5～3/5，封口并用硫酸纸或牛皮纸包扎。 2 DB6108/T 20.4—2021 5.2.4 灭菌 装好的摇瓶放入高压灭菌锅内灭菌，设置温度 121℃～126℃，灭菌 25min～30min。 5.2.5 接种 培养基冷却后置于消毒后的超净工作台上，严格按照无菌操作程序，将母种块切割成 3mm～5mm 颗 粒，迅速转接与待接种摇瓶培养基内，每 100mL 液体培养基接种 10 粒～15 粒。 5.2.6 培养 接种后在（16±2）℃环境下静置培养 2d～3d，待接入的菌种块萌发出白色菌丝体后，置于振荡培 养箱，100 次/分钟振荡培养 5d～7d，即可培养出成熟的摇瓶菌种。 5.3 5.3.1 发酵罐液体菌种生产 发酵罐维护 检查发酵罐的全部阀门、安全阀、压力表正常完好，并对罐内外和全部阀门用流水冲洗，达到无死 角、内壁无任何残留物。发酵罐初次使用、出现杂菌、长期放置、更换品种等应煮罐和空消，蒸汽压力 0.15Mpa、温度 126℃，维持 40min。 5.3.2 基质配制 按照每 1000ml 水加入玉米粉 7.5g、黄豆粉 5g、葡萄糖 20g、蛋白胨 2g、磷酸二氢钾 1g、硫酸镁 0.5g 比例配制。生产用水应符合 GB 5749 相关规定。 5.3.3 投料和定容 用水把玉米粉、黄豆粉和配方中其他原料搅拌均匀，不能有结块，通过吸管或漏斗加入发酵罐内， 液体量为罐体容量的 70%-80%为宜。然后加入 0.03%消泡剂，拧紧上料口盖。 5.3.4 气动搅拌 调整控温箱温度至 125℃，打开罐体加热棒开始对罐体进行加热，在 100℃之前一直开启罐体夹层 出水阀，放掉夹层里的虚压和多余的水。温度在 70℃以下时打开空气压缩机，通过其储气罐和空气过 滤器对罐体培养基进行气动搅拌，防止原料结块。 5.3.5 灭菌 当夹层出水阀出热蒸汽 3min～5min 后关闭，当罐体压力表达到 0.12Mpa，温度达到 121℃以上时， 保持 90min～120min。 5.3.6 冷却 灭菌结束，关闭加热棒和空气过滤器灭菌阀与排气阀，缓慢打开空气过滤器排水阀降压至 0Mpa， 加热层通入冷水循环降温，降温过程中向发酵罐内通入无菌空气同时调整排气阀，维持罐体压力在 0.04Mpa～0.05Mpa，直至培养液温度降至 25℃以下时，关闭加热层进水阀。 5.3.7 接种 用带有手柄的内径略大于接种口的铁丝圈缠绕纱布，蘸上 95%酒精。打开罐体放气阀使压力降至 0Mpa，利用火焰保护接种，把火焰圈套在接种口上，点燃火焰圈后关闭放气阀。打开接种口，然后快、 3 DB6108/T 20.4—2021 稳、轻地接入摇瓶菌种，拧紧接种口的螺丝。接种量为罐内培养基总量的 0.3%～0.5%。 5.3.8 培养 通过气泵充气和调整放气阀调节罐体压力表压力在 0.02Mpa～0.03Mpa，温度控制在（16±2）℃的 条件下进行液体菌种培养 5d～7d 可达到培养指标。 6 液体菌种的使用 6.1 接种环境 应符合 GB 50073 标准要求。 6.2 接种器消毒