中华人民共和国国家标准 GB4789.40—2024 食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌检验 2024-02-08发布 2024-08-08实施 中华人民共和国国家卫生健康委员会 国家市场监督管理总局发布前 言 本标准代替GB4789.40—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属(阪崎肠 杆菌)检验》。 本标准与GB4789.40—2016相比,主要变化如下: ———修改了标准名称; ———标准适用范围增加了婴幼儿辅助食品; ———增加了PCR鉴定方法作为选做内容; ———删除了挑取黄色菌落和生化鉴定中的产黄色素和苦杏仁苷项目; ———修改了培养基和试剂pH调节方法; ———修改了预热、选择性增菌温度以及TSA平板的培养温度和时间; ———修改了生化反应的培养温度及氨基酸培养基的制备。 ⅠGB4789.40—2024食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌检验 1 范围 本标准规定了食品中克罗诺杆菌(Cronobacterspp.)的检验方法。 本标准适用于婴幼儿配方食品、婴幼儿辅助食品、乳及乳制品及其原料中克罗诺杆菌的检验。 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下。 2.1 恒温培养箱:36℃±1℃,41.5℃±1℃。 2.2 冰箱:2℃~5℃,-20℃。 2.3 恒温水浴箱:41.5℃±1℃。 2.4 天平:感量0.1g、0.01g。 2.5 振荡器。 2.6 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。 2.7 无菌容器:容量100mL、200mL、2000mL。 2.8 无菌培养皿:直径90mm。 2.9 pH计或pH比色管或精密pH试纸。 2.10 微生物生化鉴定系统。 2.11 PCR仪。 2.12 离心机:转速≥12000r/min。 2.13 凝胶成像系统或紫外检测仪。 2.14 琼脂糖水平电泳仪或毛细管电泳仪。 2.15 PCR反应管。 2.16 1.5mL离心管。 2.17 10μL接种环。 3 培养基和试剂 3.1 缓冲蛋白胨水(bufferedpeptonewater,BPW):见A.1。 3.2 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素(modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycin medium,mLST-Vm):见A.2。 3.3 克罗诺杆菌显色培养基。 3.4 胰蛋白胨大豆琼脂(trypticasesoyagar,TSA):见A.3。 3.5 生化鉴定试剂盒。 3.6 氧化酶试剂:见A.4。 3.7 L-赖氨酸脱羧酶培养基:见A.5。 1GB4789.40—20243.8 L-鸟氨酸脱羧酶培养基:见A.6。 3.9 L-精氨酸双水解酶培养基:见A.7。 3.10 糖类发酵培养基:见A.8。 3.11 西蒙氏柠檬酸盐培养基:见A.9。 3.12 内转录间隔区(its)PCR引物见表1,基因扩增靶标参考序列见附录B。 3.13 5U/μL耐热DNA聚合酶。 3.14 2.5mmol/dNTPs:dATP、dTTP、dCTP、dGTP。 3.15 25mmol/LMgCl2。 3.16 10×PCR缓冲液:见A.10。 3.17 克罗诺杆菌质控菌株:具有菌种保藏资质单位提供的ATCC29544或等效菌株。 3.18 大肠埃希氏菌质控菌株:具有菌种保藏资质单位提供的ATCC25922或等效菌株。 3.19 DNA提取试剂:细菌基因组DNA提取试剂盒。 3.20 商品化PCR反应预混液。 3.21 标准(高熔点)琼脂糖:分析纯。 3.22 核酸染色剂。 3.23 分子质量标准:100bpDNAladder。 3.24 50×TAE电泳缓冲液:见A.11。 3.25 6×DNA加样缓冲液:见A.12。 第一法 克罗诺杆菌定性检验 4 检验程序 克罗诺杆菌检验程序见图1。 2GB4789.40—2024