中华人民共和国国家标准 GB5009.198—2016 食品安全国家标准 贝类中失忆性贝类毒素的测定 2016-12-23发布 2017-06-23实施 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 国家食品药品监督管理总局发布GB5009.198—2016 Ⅰ 前 言 本标准代替GB/T5009.198—2003《贝类 记忆丧失性贝类毒素软骨藻酸的测定》、SN/T1070— 2002《进出口贝类中记忆丧失性贝类毒素检验方法》、SN/T1867—2007《进出口贝类中软骨藻酸的检测 方法 液相色谱-串联质谱法》、SN/T2663—2010《贝类中失忆性贝类毒素检验方法 酶联免疫吸附 法》。 本标准与GB/T5009.198—2003相比,主要变化如下: ———标准名称修改为“食品安全国家标准 贝类中失忆性贝类毒素的测定”; ———修改了固相萃取条件; ———改变了流动相; ———增加了酶联免疫吸附法; ———增加了液相色谱-串联质谱法。GB5009.198—2016 1 食品安全国家标准 贝类中失忆性贝类毒素的测定 1 范围 本标准规定了贝类中失忆性贝类毒素测定的酶联免疫吸附法、液相色谱法和液相色谱-串联质 谱法。 本标准中酶联免疫吸附法适用于贝类及其制品中失忆性贝类毒素的测定,液相色谱法和液相色谱- 串联质谱法适用于贝类及其制品(不包括盐渍制品)中失忆性贝类毒素软骨藻酸(DA)的测定。 酶联免疫吸附法 2 原理 本方法测定基础是竞争性酶联免疫反应,酶标板上包被有针对软骨藻酸抗体的捕捉抗体,加入抗软 骨藻酸抗体、标准液或样品溶液及软骨藻酸酶标记物,游离的失忆性贝类毒素与软骨藻酸酶标记物竞争 软骨藻酸抗体,同时软骨藻酸抗体与捕捉抗体连接。没有结合的酶标记物在洗涤步骤中被除去。将酶 基质和显色剂加入到微孔中并且孵育。结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应 终止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm测量微孔溶液的吸光度值,试样中失忆性贝类毒素的含 量与吸光度值成反比,按绘制的标准曲线定量计算。 3 试剂和材料 除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。 3.1 试剂 3.1.1 甲醇(CH3OH)。 3.1.2 十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)。 3.1.3 氯化钠(NaCl)。 3.1.4 氯化钾(KCl)。 3.1.5 磷酸二氢钾(KH2PO4)。 3.1.6 吐温-20(C58H114O26)。 3.1.7 抗DA抗体。 3.1.8 牛血清白蛋白(BSA)。 3.1.9 DA酶标记物。 3.1.10 过氧化氢(H2O2)。 3.1.11 3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB,C16H20N2)。 3.1.12 硫酸(H2SO4)。GB5009.198—2016 2 3.2 试剂配制 3.2.1 PBS溶液(pH7.4):分别称取磷酸二氢钾0.20g、十二水合磷酸氢二钠2.90g、氯化钠8.00g、氯 化钾0.20g,加水溶解并定容至1000mL。 3.2.2 抗体稀释液:称取1.0gBSA,加PBS溶液(pH7.4)溶解并定容至1000mL。 3.2.3 抗DA抗体工作液:抗DA抗体用抗体稀释液稀释至工作浓度。 3.2.4 DA酶标记物工作液:用抗体稀释液将DA酶标记物稀释至工作浓度。 3.2.5 洗脱液:吸取0.5mL吐温-20,用PBS溶液(pH7.4)稀释至1000mL。 3.2.6 硫酸溶液(6mol/L):吸取319.2mL硫酸,缓缓加至600mL水中,并用水稀释至1000mL。 3.3 标准品 软骨藻酸(DA,C15H21NO6,CAS号14277-97-5)标准溶液。 3.4 标准溶液配制 DA标准系列工作液:准确吸取适量DA标准溶液用PBS溶液稀释并定容,配制成质量浓度分别为 0ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL和10.0ng/mL的DA标准系列工作液。现 用现配。 3.5 材料 3.5.1 包被有DA捕捉抗体的微孔板。 注:商业化试剂盒若评价技术参数达到本标准的要求则也适合于本标准,参见附录A。 3.5.2 水相微孔滤膜:0.45μm。 4 仪器和设备 4.1 酶标仪。 4.2 天平:感量为0.01g。 4.3 均质器。 4.4 离心机:转速≥6000r/min。 5 分析步骤 5.1 样品采集 至少采集10个贝类样品,并使贝肉达200g以上。冷冻样品置于保温盒中冷冻送检,或保证其处 于低温状态(0℃~10℃)送检。如为带壳样品,应开壳,去除水分后冷冻送检。 5.2 试样制备 5.2.1 生鲜带壳样品 用清水将贝类样品外表彻底洗净,切断闭壳肌,开壳,用水淋洗内部去除泥沙及其他外来物。将闭 壳肌和连接在胶合部的组织分开,取出贝肉,切勿割破肉体。开壳前不要加热或用麻醉剂。收集100g 贝肉置于孔径约2mm的金属筛网上,沥水5min,检出碎壳等杂物,将贝肉均质,备用。