中华人民共和国国家标准
GB5413.40—2016
食品安全国家标准
婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定
2016-08-31发布 2017-03-01实施
中华人民共和国
国家卫生和计划生育委员会发布GB5413.40—2016
1 食品安全国家标准
婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定
1 范围
本标准规定了液相色谱法测定游离核苷酸总量的方法。
本标准适用于婴幼儿食品和乳品中游离核苷酸总量(包括胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、次黄嘌呤
核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、腺嘌呤核苷酸)的测定。
2 原理
试样经过水提取,用沉淀剂沉淀蛋白质后,通过高效液相色谱分离,用紫外检测器外标法测定试样
中核苷酸的含量。
3 试剂与材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的三级水,液相色谱流动相用水
为GB/T6682规定的一级水。
3.1 试剂
3.1.1 淀粉酶:酶活力≥1.5U/mg。
3.1.2 冰乙酸(CH3COOH)。
3.1.3 四丁基硫酸氢铵[(C4H9)4NHSO4]。
3.1.4 甲醇(CH3OH)。
3.1.5 磷酸氢二钾(K2HPO4)。
3.1.6 磷酸二氢钾(KH2PO4)。
3.1.7 磷酸(H3PO4)。
3.2 试剂配制
3.2.1 乙酸溶液(100mL/L):吸取10mL冰乙酸,加水定容到100mL。
3.2.2 磷酸氢二钾溶液(0.1mol/L):称取2.28g磷酸氢二钾,用超纯水溶解并定容到100mL。
3.2.3 磷酸盐缓冲液(1.40mmol/L四丁基硫酸氢铵,0.01mol/L磷酸二氢钾):称取1.360g磷酸二氢
钾,加0.4753g四丁基硫酸氢铵,加900mL水溶解,用磷酸氢二钾溶液调pH至3.2,用水定容到
1000mL。一周内使用。
3.3 核苷酸标准品
3.3.1 胞嘧啶核苷酸(CMP)(C9H14N3O8P):纯度≥99%。
3.3.2 腺嘌呤核苷酸(AMP)(C10H14N5O7P):纯度≥99%。
3.3.3 尿嘧啶核苷酸(UMP)(C9H13N2O9P):纯度≥99%。GB5413.40—2016
2 3.3.4 鸟嘌呤核苷酸(GMP)(C10H14N5O8P):纯度≥99%。
3.3.5 次黄嘌呤核苷酸(IMP)(C10H13N4O8P):纯度≥99%。
3.4 标准溶液配制
核苷酸标准混合液(应当天配置):分别称取核苷酸标准品CMP、AMP、UMP各10mg、GMP和
IMP各5mg(准确至0.1mg),用超纯水溶解转移至同一个100mL容量瓶中,用水定容至100mL。此
标准溶液浓度为:CMP、AMP、UMP各100μg/mL;GMP、IMP各50μg/mL。每个组分称取的质量都
要校正水分和钠盐含量,以酸型计。
4 仪器与设备
4.1 高效液相色谱仪:配有紫外检测器或二极管阵列检测器。
4.2 天平:感量0.1mg。
4.3 pH计:精度0.01。
4.4 恒温培养箱:±2℃。
5 分析步骤
5.1 试样制备
5.1.1 样品预处理
5.1.1.1 含淀粉的试样
称取混合均匀的固体试样约5g(精确至0.1mg),于100mL锥形瓶中,加入约0.2g淀粉酶,加入
20mL热水(30℃~40℃)充分溶解试样,或称取混合均匀的液体试样约20g(精确至1mg)于100mL
锥形瓶中,加入约0.2g淀粉酶摇匀,于37℃±2℃培养箱内酶解30min。取出冷却至室温。
5.1.1.2 不含淀粉的试样
称取混合均匀的固体试样约5g(精确至0.1mg),于100mL锥形瓶中,加入20mL热水(50℃~
60℃)充分溶解试样,冷却至室温,或称取混合均匀的液体试样约20g(精确至1mg)于100mL锥形瓶中。
5.1.2 待测液的制备
用醋酸溶液调试样溶液pH4.1,移入50mL容量瓶中,定容,滤纸过滤,所得滤液用0.45μm微膜
过滤备用。
5.2 参考色谱条件
5.2.1 流动相:磷酸盐缓冲液+甲醇=1000+40。
5.2.2 色谱柱:C18-T反相色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)或具同等性能的色谱柱。
5.2.3 流速:1mL/min。
5.2.4 波长:254nm。
5.2.5 柱温:25℃。
5.2.6 进样体积:10μL。
注:必要时可以用磷酸或磷酸氢二钾溶液适当调流动相的pH至分离情况最佳。GB5413.40—2016
3 5.3 标准曲线绘制
分别吸取标准混合溶液2mL、4mL、6mL、8mL、10mL,加超纯水定容至50mL,配成核苷酸系列
标准工作液,见表1。
表1 核苷酸系列标准工作液各组分浓度 单位为微克每毫升
序号 CMP AMP UMP GMP IMP
1 4 4 4 2 2
2 8 8 8 4 4
3 12 12 12 6 6
4 16 16 16 8 8
5 20 20 20 10 10
将上核苷酸系列标准工作液分别注入高效液相色谱仪中,测定相应的峰面积或峰高。以峰面积或
峰高为纵坐标,以标准测定液浓度为横坐标绘制标准曲线。
5.4 试样溶液的测定
将制备好的试样溶液注入高效液相色谱仪中,测定相应的峰面积或峰高。根据标准曲线得到待测
液中核苷酸的浓度(μg/mL)。
6 分析结果的表述
6.1 结果计算
试样中游离核苷酸各组分的含量Xi(CMP、UMP、GMP、IMP、AMP)按式(1)计算:
Xi=Ci×Vi×n
mi×1000×100 ……………………(1)
式中:
Xi———试样中核苷酸各组分的含量(分别是:XCMP、XUMP、XGMP、XIMP、XAMP),单位为毫克每百克
(mg/100g);
Ci———试样溶液中核苷酸各组分的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);
Vi———试样溶液的体积,单位为毫升(mL);
n———样液稀释倍数;
mi———试样的质量,单位为克(g)。
试样中游离核苷酸的总量按式(2)计算:
X总=ΣXi=XCMP+XAMP+XUMP+XGMP+XIMP……………………(2)
式中:
X总 ———试样中游离核苷酸的总量,单位为毫克每百克(mg/100g);
XCMP———按式(1)计算出的游离胞嘧啶核苷酸含量,单位为毫克每百克(mg/100g);
XAMP———按式(1)计算出的游离腺嘌呤核苷酸含量,单位为毫克每百克(mg/100g);
XUMP———按式(1)计算出的游离尿嘧啶核苷酸含量,单位为毫克每百克(mg/100g);
XGMP———按式(1)计算出的游离鸟嘌呤核苷酸含量,单位为毫克每百克(mg/100g);
XIMP———按式(1)计算出的游离次黄嘌呤核苷酸含量,单位为毫克每百克(mg/100g)。
GB 5413.40-2016 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定
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