书 书 书犐犆犛 ６５ ． １２０ 犆犆犛犅 ４６ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 １９４２３ — ２０２０ /G21 /G22 ＧＢ ／ Ｔ１９４２３ — ２００３ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狀犻犮犪狉犫犪狕犻狀犻狀犳犲犲犱狊 ２０２０  １２  １４ /G2B /G2C ２０２１  ０７  ０１ /G2D /G2E /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G2B /G2C书 书 书前 　　 言 　　 本文件按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２０２０ 《 标准化工作导则 　 第 １ 部分 ： 标准化文件的结构和起草规则 》 的规定起草 。 本文件代替 ＧＢ ／ Ｔ１９４２３ — ２００３ 《 饲料中尼卡巴嗪的测定 　 高效液相色谱法 》， 与 ＧＢ ／ Ｔ１９４２３ — ２００３ 相比 ， 除编辑性修改外 ， 主要技术变化如下 ： ——— 增加了液相色谱  串联质谱测定方法 （ 见第 ５ 章 ）； ——— 更改了高效液相色谱法的检出限 ， 增加了定量限 （ 见第 １ 章 ， ２００３ 年版的第 １ 章 ）； ——— 更改了高效液相色谱法的提取和净化方法 （ 见 ４．５．１ 、 ４．５．２ ， ２００３ 年版的 ７．１ ）； ——— 更改了高效液相色谱法的试验数据处理 （ 见 ４．６ ， ２００３ 年版的 ７．４ ）。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ７６ ） 提出并归口 。 本文件起草单位 ： 广东省农业科学院农产品公共监测中心 、 浙江省兽药饲料监察所 、 贵州省兽药饲料检测所 。 本文件主要起草人 ： 王威利 、 丁晨红 、 张志健 、 赵贵 、 万凯 、 王旭 、 李亚菲 、 苏秋权 、 林雪贤 、 章厉 稢 、 侯轩 、 黄晓梅 、 殷秋妙 、 梁锐 、 崔泽锋 、 谢丽丽 、 王英 。 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为 ： ——— ＧＢ ／ Ｔ１９４２３ — ２００３ 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 １９４２３ — ２０２０ 饲料中尼卡巴嗪的测定 １ 　 范围 本文件描述了饲料中尼卡巴嗪的高效液相色谱和液相色谱  串联质谱测定方法 。 本文件适用于配合饲料 、 浓缩饲料和添加剂预混合饲料中尼卡巴嗪的测定 。 本文件高效液相色谱法中配合饲料 、 浓缩饲料的检出限为 ０．５ｍｇ ／ ｋｇ ， 定量限为 １ｍｇ ／ ｋｇ ， 添加剂预混合饲料的检出限为 １ｍｇ ／ ｋｇ ， 定量限为 ２ｍｇ ／ ｋｇ ； 液相色谱  串联质谱法的检出限为 ０．０２ｍｇ ／ ｋｇ ， 定量限为 ０．０５ｍｇ ／ ｋｇ 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。 其中 ， 注日期的引用文件 ， 仅该日期对应的版本适用于本文件 ； 不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＧＢ ／ Ｔ２０１９５ 　 动物饲料 　 试样的制备 ３ 　 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 ４ 　 高效液相色谱法 ４ ． １ 　 原理 试样中的尼卡巴嗪用甲醇  乙腈混合溶液提取 ， 经 ＭＡＸ 固相萃取小柱净化后 ， 用高效液相色谱仪检测 ， 外标法定量 。 ４ ． ２ 　 试剂或材料 除非另有规定 ， 仅使用分析纯试剂 。 ４ ． ２ ． １ 　 水 ： ＧＢ ／ Ｔ６６８２ ， 一级 。 ４ ． ２ ． ２ 　 乙腈 ： 色谱纯 。 ４ ． ２ ． ３ 　 提取溶液 ： 甲醇 ＋ 乙腈 ＝５０＋５０ 。 ４ ． ２ ． ４ 　 ８０％ 乙腈溶液 ： 准确量取 ８０ｍＬ 乙腈 （ ４．２．２ ）， 加水定容至 １００ｍＬ ， 混匀 。 ４ ． ２ ． ５ 　 氢氧化钠溶液 （ ０．２ｍｏｌ ／ Ｌ ）： 准确量取 ０．８ｇ 氢氧化钠 ， 用水稀释并定容至 １００ｍＬ ， 混匀 。 ４ ． ２ ． ６ 　 ４％ 甲酸乙腈溶液 ： 准确量取 ４ｍＬ 甲酸 ， 用乙腈 （ ４．２．２ ） 稀释并定容至 １００ｍＬ ， 混匀 。 ４ ． ２ ． ７ 　 标准储备溶液 （ １０００ μ ｇ ／ ｍＬ ）： 称取尼卡巴嗪 （ Ｎｉｃａｒｂａｚｉｎ ， Ｃ １９ Ｈ １８ Ｎ ６ Ｏ ６ ， ＣＡＳ 号 ： ３３０９５０ ， 含量不低于 ９９％ ） 标准品 １０ｍｇ （ 精确至 ０．０１ｍｇ ） 于 １０ｍＬ 容量瓶中 ， 加入 ２ｍＬ 二甲基亚砜溶解 ， 用乙腈 （ ４．２．２ ） 定容 ， 摇匀 ， 于 －１８℃ 以下保存 ， 有效期为 ３ 个月 。 ４ ． ２ ． ８ 　 标准中间溶液 （ １００ μ ｇ ／ ｍＬ ）： 准确量取标准储备溶液 （ ４．２．７ ） １ｍＬ ， 置于 １０ｍＬ 容量瓶中 ， 用乙 １ 犌犅 ／ 犜 １９４２３ — ２０２０ 腈 （ ４．２．２ ） 稀释至刻度 ， 于 －１８℃ 以下保存 ， 有效期为 ３ 个月 。 ４ ． ２ ． ９ 　 标准系列溶液 ： 准确移取适量标准中间溶液 （ ４．２．８ ） 于 １０ｍＬ 容量瓶中 ， 用 ８０％ 乙腈溶液 （ ４．２．４ ） 稀释定容配成标准系列溶液 ， 质量浓度分别为 ： ０．０４ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ０．１ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ０．２ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ０．５ μ ｇ ／ ｍＬ 、 １ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ５ μ ｇ ／ ｍＬ 、 １０ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ２０ μ ｇ ／ ｍＬ ， 临用现配 。 ４ ． ２ ． １０ 　 ＭＡＸ 固相萃取小柱 ： ６０ｍｇ ／ ３ｍＬ ， 或性能相当者 。 ４ ． ２ ． １１ 　 微孔滤膜 ： ０．４５ μ ｍ ， 有机系 。 ４ ． ３ 　 仪器设备 ４ ． ３ ． １ 　 高效液相色谱仪 ： 配紫外检测器 ／ 二极管阵列检测器 。 ４ ． ３ ． ２ 　 分析天平 ： 感量 ０．００１ｇ 和 ０．０１ｍｇ 。 ４ ． ３ ． ３ 　 涡漩混合器 。 ４ ． ３ ． ４ 　 氮吹仪 。 ４ ． ３ ． ５ 　 超声波清洗机 。 ４ ． ３ ． ６ 　 冷冻离心机 ： 转速不低于 ８０００ｒ ／ ｍｉｎ 。 ４ ． ３ ． ７ 　 固相萃取装置 。 ４ ． ４ 　 样品 按 ＧＢ ／ Ｔ２０１９５ 制备试样 ， 至少 ２００ｇ ， 粉碎使其全部通过 ０．４２ｍｍ 孔径的分析筛 ， 充分混匀 ， 装入磨口瓶中保存 ， 备用 。 ４ ． ５ 　 试验步骤 ４ ． ５ ． １ 　 提取 平行做两份试验 。 称取试样 ２ｇ （ 添加剂预混合饲料 ０．２ｇ ～ １ｇ ， 尼卡巴嗪含量小于 １０ｍｇ ）， 精确至 ０．００１ｇ ， 于 ５０ｍＬ 离心管中 ， 准确加入 ２５ｍＬ 提取溶液 （ ４．２．３ ）， 涡漩混匀 １ｍｉｎ ， 置于 ５０℃ 水浴超声提取 ２０ｍｉｎ ， 每隔 ５ｍｉｎ 充分振荡一次 。 于 ８０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５ｍｉｎ 。 取上清液于 ５０ｍＬ 离心管中 ， 残渣用 ２５ｍＬ 提取溶液 （ ４．２．３ ） 重复提取一次 ， 合并两次提取液 ， 混匀 。 准确移取 ５ｍＬ 提取液于 １５ｍＬ 离心管中 ， 加入 ０．２ｍＬ 氢氧化钠溶液 （ ４．２．５ ）， 涡漩混匀后 ， 得到试样待净化溶液 ， 备用 。 　　 注 ： 当添加剂预混合饲料中尼卡巴嗪含量大于 １％ 时 ， 建议适当减少称样量 （ 试样中约相当于尼卡巴嗪含量 １０ｍｇ ） 进行测定 。 ４ ． ５ ． ２ 　 净化 ＭＡＸ 固相萃取小柱 （ ４．２．１０ ） 先用 ３ｍＬ 提取溶液 （ ４．２．３ ） 预淋洗 。 将 ４．５．１ 得到的试样待净化溶液全部过柱 ， 抽干 。 用 ５ｍＬ４％ 甲酸乙腈溶液 （ ４．２．６ ） 洗脱 ， 收集洗脱液 ， 于 ５０℃ 水浴中氮气吹至少于 ２ｍＬ ， 用 ８０％ 乙腈溶液 （ ４．２．４ ） 定容至 ５ｍＬ ， 涡漩混匀后过 ０．４５ μ ｍ 微孔滤膜 ， 得到试样溶液 ， 用高效液相色谱仪测定 。 ４ ． ５ ． ３ 　 测定 ４ ． ５ ． ３ ． １ 　 高效液相色谱参考条件 色谱柱 ： Ｃ １８ 柱 ， 柱长 ２５０ｍｍ ， 内径 ４．６ｍｍ ， 粒径 ５．０ μ ｍ ； 或性能相当者 。 流动相 ： 乙腈 ＋ 水 ＝５０＋５０ 。 流速 ： １．０ｍＬ ／ ｍｉｎ 。 柱温 ： ３０℃ 。 ２ 犌犅 ／ 犜 １９４２３ — ２０２０ 进样量 ： ２０ μ Ｌ 。 检测波长 ： ３５０ｎｍ 。 ４ ． ５ ． ３ ． ２ 　 标准系列溶液和试样溶液测定 在仪器的最佳条件下 ， 分别取标准系列溶液 （ ４．２．９ ） 和 ４．５．２ 得到的试样溶液上机测定 。 尼卡巴嗪 标准溶液的高相液相色谱图见附录 Ａ 。 ４ ． ５ ． ３ ． ３ 　 定性 以保留时间定性 ， 试样溶液中尼卡巴嗪保留时间应与标准系列溶液中尼卡巴嗪的保留时间一致 ， 其 相对偏差在 ±２．５％ 之内 。 ４ ． ５ ． ３ ． ４ 　 定量