ICS67.180.10 X31 中华人民共和国国家标准 GB/T32946—2016 蜂蜜中脯氨酸的测定 高效液相色谱法 Determinationofprolineinhoney—Highperformanceliquidchromatography 2016-08-29发布 2017-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华全国供销合作总社提出。 本标准由全国蜂产品标准化工作组归口。 本标准起草单位:中国农业科学院蜜蜂研究所、农业部蜂产品质量监督检验测试中心(北京)、中国 养蜂学会。 本标准主要起草人:李熠、张金振、黄京平、吴杰、吴黎明、赵静、薛晓锋、周金慧、陈芳、王鹏、陈兰珍。 ⅠGB/T32946—2016 蜂蜜中脯氨酸的测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了蜂蜜中脯氨酸含量的高效液相色谱测定方法。 本标准适用于蜂蜜中脯氨酸含量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 方法提要 试样中的脯氨酸用硼酸缓冲液提取后,经柱前衍生,液相色谱荧光检测器检测,外标法定量。 4 试剂和材料 4.1 除非另有说明,均使用分析试剂,水为GB/T6682规定的一级水。 4.2 甲醇:色谱纯。 4.3 乙腈:色谱纯。 4.4 四氢呋喃:色谱纯。 4.5 乙酸钠。 4.6 乙酸。 4.7 硼酸。 4.8 乙二胺四乙酸二钠。 4.9 氢氧化钠。 4.10 磷酸。 4.11 盐酸。 4.12 L-脯氨酸标准品(CAS号:147-85-3):纯度≥99%。 4.13 4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂恶二唑(NBD-F,CAS号:29270-56-2):纯度≥99%。 4.14 氢氧化钠溶液(0.1mol/L):称取2.00g氢氧化钠,溶于500mL水中,混匀,转移至聚乙烯瓶中, 密闭放置。 4.15 乙酸钠缓冲液(0.1mol/L):称取13.60g乙酸钠,溶解于1L水中,用乙酸调节pH至7.2,抽滤 脱气。 4.16 硼酸缓冲液(0.1mol/L):称取乙二胺四乙酸二钠0.186g、硼酸3.09g,溶解于500mL水中,氢 氧化钠溶液调pH至8.0。 4.17 盐酸溶液(0.1mol/L):取8.33mL盐酸,定容至1L。 4.18 NBD-F溶液(100mmoL/L):称取NBD-F0.0183g于棕色液相进样瓶中,加入1mL乙腈溶解, 1GB/T32946—2016 密封保存。 4.19 脯氨酸标准储备液(1000mg/L):准确称取适量脯氨酸标准品,用硼酸缓冲液溶解后,贮存在 4℃冰箱中。 4.20 0.22μm水系滤膜。 5 仪器和设备 5.1 高效液相色谱仪:配荧光检测器。 5.2 分析天平:感量0.01g,0.001g,0.00001g。 5.3 涡旋混匀器。 5.4 pH计:测量精度±0.02。 5.5 恒温水浴锅。 5.6 超声波清洗器。 6 试样的制备与保存 将样品搅拌均匀,分出0.5kg试样置于样品瓶中,密封标记,于4℃下保存。 7 分析步骤 7.1 提取 称取试样1g,精确至0.001g,置于100mL烧杯中,加入20.0mL硼酸缓冲液,用玻璃棒轻轻搅拌 溶解,超声提取10min。将溶液转移至50mL容量瓶中,用硼酸缓冲液定容至刻度,混匀,0.22μm滤 膜过滤,滤液待衍生化。 7.2 衍生化 取200μL样品溶液于棕色液相色谱进样瓶中,再分别加入70μL乙腈、30μLNBD-F溶液,密封, 涡旋混匀,置于60℃恒温水浴避光衍生10min,取出立即放入冰水中冷却,加入100μL盐酸溶液终止 反应,混匀,待测。 7.3 液相色谱参考条件 液相色谱条件参考以下参数: a) 色谱柱:C18,5μm,150mm×4.6mm(内径),或相当者; b) 流动相:A:0.1mol/L乙酸钠缓冲液-甲醇-四氢呋喃(900+95+5);B:甲醇; c) 柱温:30℃; d) 进样量:20μL; e) 荧光检测波长:激发波长470nm,发射波长530nm; f) 梯度洗脱程序见表1。 2GB/T32946—2016 表1 梯度洗脱程序(VA+VB) 时间/min A/% B/% 流速/(mL/min) 0.00 100 0 1.0 0.50 75 25 1.0 7.00 75 25 1.0 8.00 0 100 1.0 10.00 0 100 1.0 12.00 100 0 1.0 15.00 100 0 1.0 7.4 液相色谱测定 用硼酸缓冲液稀释标准储备液,依次配成20.00mg/L、10.00mg/L、5.00mg/L、2.50mg/L、 1.25mg/L、0.625mg/L的脯氨酸标准工作溶液,按7.2步骤进行衍生。在上述色谱条件下,测定6个 浓度水平标准工作溶液的峰面积,以峰面积对相应质量浓度绘制标准工作曲线,然后测定未知样品,用 标准工作曲线对未知样品进行定量。样品溶液中脯氨酸的响应值应在仪器的线性范围内。脯氨酸的参 考保留时间为5.6min。脯氨酸标准溶液色谱图和蜂蜜样品色谱图参见附录A中图A.1和图A.2。 7.5 平行试验 按上述步骤,对同一试样进行两次平行测定。 8 结果计算 结果用色谱数据处理软件或按式(1)计算: X=ρ×V m……………………(1) 式中: X———试样中脯氨酸的含量,单位为毫克每千克(mg/kg); ρ———从标准工作曲线上得到的被测组分溶液的质量浓度,单位为毫克每升(mg/L); V———定容体积,单位为毫升(mL); m———样液所代表试样的质量,单位为克(g)。 测定结果取其两次测定的算术平均值,计算结果保留小数点后一位。 9 定量下限 本方法的定量下限为10.0mg/kg。GB/T32946—2016 GB/T32946—2016 附 录 A (资料性附录) 色谱图 A.1 脯氨酸标准溶液色谱图见图A.1。 图A.1 脯氨酸标准溶液色谱图(5.00mg/L) A.2 蜂蜜样品色谱图见图A.2。 图A.2 蜂蜜样品色谱图