ICS65.020.01 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T33117—2016 小麦基腐病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofHelgardiaherpotrichoides 2016-10-13发布 2017-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国山东出入境检验检疫局、青岛检验检疫技术发展中心、中华人民 共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国湖北出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:吴兴海、王英超、余冬冬、封立平、厉艳、纪瑛、甘琴华、吴翠萍、邵秀玲、王振华。 ⅠGB/T33117—2016 小麦基腐病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了小麦基腐病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于小麦属、黑麦属等禾本科寄主中小麦基腐病菌的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 SN/T2589 植物病原真菌检测规范 3 小麦基腐病菌基本信息 学名:Helgardiaherpotrichoides(Fron)Crous&W.Gams2003 异名:无性态CercosporellaherpotrichoidesFron1912,Pseudocercosporellaherpotrichoides (Fron)Deighton1973.,Ramulisporaherpotrichoides(Fron)Arx1983;有性态Tapesiayallundae var.yallundae,Oculimaculayallundae(Wallwork&Spooner)Crous&W.Gams2003。 传播途径:主要以病残体混于种子间进行远距离传播。 小麦基腐病菌的其他信息参见附录A。 4 方法原理 病原菌的为害症状、分离培养性状、形态特征和特异性PCR检测结果等是该检疫鉴定方法的主要 依据。 5 仪器设备和主要试剂 5.1 仪器设备 生物显微镜、电子天平(感量0.001g)、离心机、普通冰箱、超低温冰箱(-80℃)、恒温水浴锅、涡旋 振荡器、恒温光照培养箱、高压灭菌器、生物安全柜、PCR仪、电泳仪、凝胶分析成像系统、全自动DNA 提取仪。 5.2 主要试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定。 表面活性剂吐温-20、琼脂、青霉素、链霉素、0.5%次氯酸钠(NaClO)。 1GB/T33117—2016 6 现场检疫 按照SN/T2589,仔细检查寄主植物的茎、枝条、叶片等部位是否出现疑似症状(参见附录A)。对 可疑植物病残体和土壤应取样送实验室做进一步检验,取样方法和步骤按照SN/T2122。 7 实验室检疫 7.1 症状检查 小麦基腐病菌主要引起鞘枯和叶枯,病斑多在地际到10cm之间的叶鞘和茎秆上形成椭圆形或“眼 纹”状病斑。检查种子中有无附着病残体、土壤等。 7.2 PCR凝胶电泳初筛检测 将7.1中的样品进行PCR初筛检测,PCR凝胶电泳检测见附录B。对于阳性结果进行下一步 检测。 7.3 病原菌的分离培养 7.3.1 培养基的制备 马铃薯蔗糖培养基(PSA)、马铃薯葡萄糖培养基(PDA)、玉米琼脂培养基(CMA)及选择性培养基 的制备见附录C。 7.3.2 种子中病原菌的分离培养 取待检的进境病原菌的寄主种子样品50g放入250mL洁净的三角瓶中,加蒸馏水100mL,再加 表面活性剂吐温-201滴~2滴,用铝箔纸或培养纸将三角瓶封口,将三角瓶放在往复式振荡器上, 150g振荡洗涤5min。立即取下三角瓶,将洗涤悬浮液用干净纱布过滤后注入10mL~20mL刻度离 心管内,1000g离心3min,取出离心管,倾去上清液,再加剩余洗涤悬浮液,混合离心,直至所有洗涤 悬浮液离心完毕,留沉淀物。将沉淀物从离心管中全部移入2mL离心管中,12000g离心10min,以 移液管移取上清去除水分,在常温下将沉淀风干。对样品洗涤液中收集到的沉淀物在培养基上进行分 离培养。 7.3.3 病残体中病原菌的分离培养 将变色的可疑材料,剪成约3mm~5mm小段,用0.5%次氯酸钠表面消毒10min,再用灭菌水冲 洗30min,置于玉米琼脂培养基(CMA)平板上(配方见附录C),13℃~15℃,近紫外光照射培养,培养 7d~14d开始观察菌落形态和菌丝形态特征。 7.3.4 土壤中病原菌的分离培养 取2g土壤放入200mL灭菌水中,用磁力棒搅拌30min,使其充分混匀,悬浮液稀释10倍,取 1mL土壤稀释液涂抹于选择性PDA平板上(配方见附录C),每处理5~10个重复,15℃,全光照下培 养,培养7d~14d开始观察菌落形态和菌丝形态特征。 7.3.5 分生孢子的诱导 7.3.2、7.3.3和7.3.4获得的菌丝,可通过以下方法获得分生孢子。水琼脂培养基(WA)上2周龄菌 2GB/T33117—2016 丝,9℃,7d~10d产生初生孢子,由菌丝或孢子的水悬浮液置于PDA表面,18℃~21℃,4d则产生 大量分生孢子。 8 鉴定特征 8.1 PCR凝胶电泳初筛检测 判定结果见附录B。 8.2 培养性状 病原在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养,培养菌丝呈鹅绒状或细棉状。培养初期的整体呈凸状。 菌落圆形、光滑,边缘平坦,中央有明显的气生菌丝,菌落表面灰绿色,背面暗色,22℃生长速率平均为 1.2mm。在玉米琼脂培养基上,菌落呈墨绿色或粉红色或淡褐色。在选择性培养基上,菌落呈茶褐色。 8.3 形态特征 小麦基腐病菌有2种类型的菌丝体:一种为营养菌丝,黄褐色,线性,有分枝;一种暗色,厚壁,由膨 大的多角形细胞构成,常在植株体表形成类似子座的菌丝团。分生孢子梗无色,单生或罕有分枝,倒棒 状,产孢细胞全壁芽生合轴式产孢,孢痕不肥厚,不发亮,呈截断状。分生孢子无色,针状,直或略为弯 曲。分生孢子多数有3个~7个隔膜,偶见超过10个,大小(30μm~120μm)×(1μm~3.5μm)(见附 录D)。 子囊盘直径0.2mm~1.5mm,无柄,密集聚生,着生于簇生的灰褐色钩状菌丝之上,呈圆形或叶 状。子囊托灰褐色,杯状,后变为小盘状,边缘反卷,在子囊盘未成熟时常被白色透明或浅褐色的绒毛, 成熟时少见。子囊(35μm~50μm)×(4μm~7.4μm),内含8个子囊孢子,圆桶状纺锤形或棍棒状纺 锤形,近顶点处渐缩呈短的杆状。子囊孢子(7μm~11μm)×(1.5μm~2.3μm),透明,细的圆桶状-棒 状,棍棒状纺锤形或纺锤形,末端浑圆,直或轻微的不规则,罕见弯曲。油滴不明显,无隔膜或罕见1个 隔膜,子囊孢子在子囊内呈不规则的双行排列。侧丝丝状,长度跟子囊相近,直径2.0μm~2.5μm,顶 端钝圆,透明,有隔膜。 9 结果判定 以PCR初筛结果、病原菌培养性状、形态特征等作为鉴定依据,进行综合判定。若PCR初筛为阳 性,且与8.2、8.3鉴定特征吻合,鉴定为小麦基腐病菌。 10 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出小麦基腐病菌的样品应保存于4℃冰箱中,以备复 核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。 11 菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为小麦基腐病菌的菌株,应妥善保存。将菌株接种于PSA培养基斜面上 (配方见附录C),存活后置于4℃~8℃黑暗条件下保存,定期(3个月)转接,以防止病菌死亡,至少保 存6个月,必要时用病菌分生孢子作冻干菌种保存。对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理。 3GB/T33117—2016 12 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括样品的来源、种类、时间,实验的时间、地点、方法和结果等,并要有实验人员和 审核人员签字。PCR凝胶电泳检测应有电泳结果照片。 4GB/T33117—2016 附 录 A (资料性附录) 小麦基腐病菌其他信息 A.1 名称 中文名:小麦基腐病菌 英文名:Eyespotofcereals 学名:Helgardiaherpotrichoides(Fron)Crous&W.Gams2003。曾用学名, Pseudocercosporellaherpotrichoides(Fron)Deighton1973.,该学名分类地位:无性态属于半知菌亚门 (Deuteromycotina),丝孢菌纲(Hyphomycetes),丝孢目(Hyphomycetales),淡色孢科(Moniliaceae),假 小尾孢属(Pseudocercosporella);有性态TapesiayallundaeWallwork&Spooner1988,属于子囊菌亚 门(Ascomycota),煤炱目(Capnodiales),球腔菌科(Mycosphaerellaceae),Tapesia属。 A.2 寄主范围 小麦属(Triticum)、大麦(Hordeumvulgare)、栽培二棱大麦(HordeumdistichonL.)、黑麦 (Secalecereale)、燕麦(Avenasativa)以及山羊草属(Aegilops)、冰草属(Agropyron)、剪股颖属 (Agrostis)、看麦娘属(Alopecurus)、