ICS71.100.70 Y42 中华人民共和国国家标准 GB/T33309—2016 化妆品中维生素B6(吡哆素、盐酸吡哆素、 吡哆素脂肪酸酯及吡哆醛5-磷酸酯) 的测定 高效液相色谱法 DeterminationofvitaminB6(pyridoxine,pyridoxinehydrochloride, pyridoxinefattyacidestersandpyridoxal5-phosphate)incosmetics— Highperformanceliquidchromatography 2016-12-13发布 2017-07-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中国轻工业联合会提出。 本标准由全国香料香精化妆品标准化技术委员会(SAC/TC257)归口。 本标准起草单位:山东省产品质量监督检验研究院、聊城大学、山东省食品药品检验研究院、上海市 日用化学工业研究所。 本标准主要起草人:霍艳敏、王骏、张娟、张卉、周莉莉、段文增、邹惠玲、王艳丽、薛霞、宿书芳、 刘艳明、崔玉花、刘桂亮、张艳侠、沈敏。 ⅠGB/T33309—2016 化妆品中维生素B6(吡哆素、盐酸吡哆素、 吡哆素脂肪酸酯及吡哆醛5-磷酸酯) 的测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了化妆品中维生素B6(吡哆素、盐酸吡哆素、吡哆素脂肪酸酯及吡哆醛5-磷酸酯)的高 效液相色谱测定方法。 本标准适用于膏霜、乳液、液体类等化妆品中吡哆素、盐酸吡哆素、吡哆素脂肪酸酯及吡哆醛5-磷 酸酯的测定。 本标准方法检出限为:吡哆醛1.0mg/kg、吡哆素0.3mg/kg,定量限为:吡哆醛2.5mg/kg、吡哆素 1.2mg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 本标准通过酶解、皂化反应将样品中的维生素B6均转化为吡哆素或吡哆醛的形式,利用高效液相 色谱配荧光检测器进行分离及分析,保留时间定性,外标法定量测定维生素B6的含量。 4 试剂和材料 除非另有说明,所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。 4.1 甲醇:色谱纯。 4.2 七氟丁酸:色谱纯。 4.3 碱性磷酸酶:酶活力不小于10U/mg。 4.4 磷酸:优级纯。 4.5 氨水:优级纯,含量为25%~28%。 4.6 磷酸二氢铵:优级纯。 4.7 磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O)。 4.8 乙醇。 4.9 盐酸。 4.10 氢氧化钾水溶液:称取固体氢氧化钾250g,加入200mL水溶解。 4.11 30%磷酸水溶液(体积分数):准确量取30mL磷酸(4.4)和70mL水,混匀后备用。 4.12 30%氨水溶液(体积分数):准确量取30mL氨水(4.5)和70mL水,混匀后备用。 1GB/T33309—2016 4.13 盐酸溶液(5.0mol/L,0.1mol/L):量取40mL、0.8mL盐酸(4.9)分别放入两个100mL容量瓶 中,用水定容,分别得5.0mol/L、0.1mol/L盐酸溶液。 4.14 氢氧化钠溶液(5.0mol/L,0.1mol/L):称取20g、0.4g氢氧化钠用水溶解,分别放入两个100mL容 量瓶中,用水定容,分别得5.0mol/L、0.1mol/L氢氧化钠溶液。 4.15 离子对试剂缓冲溶液[0.02mol/L磷酸二氢铵缓冲溶液(含0.001mol/L七氟丁酸)]:称取2.30g磷 酸二氢铵,加入约980mL水溶解,用30%磷酸(4.11)或30%氨水(4.12)调节pH值至4.5,加入170μL 七氟丁酸(4.2),用水定容至1L备用。 4.16 磷酸氢二钠溶液(0.1mol/L):称取17.8g磷酸氢二钠(4.7),用水溶解,定容至1000mL,用氢氧 化钠溶液(4.14)调节pH值至9.8,备用。 4.17 碱性磷酸酶溶液(1.0g/L):称取50mg碱性磷酸酶,用水定容至50mL。临用前配制。 4.18 标准样品:吡哆素和吡哆醛,纯度不小于99.0%。维生素B6(吡哆素、盐酸吡哆素、吡哆素脂肪酸 酯和吡哆醛5-磷酸酯)的CAS号、分子式、相对分子质量、化学结构式参见附录A。 4.19 维生素B6(吡哆素、吡哆醛)标准贮备液(1mg/mL):准确称取0.025g(精确至0.0001g)吡哆 素、吡哆醛标准品,分别置于25mL容量瓶中,用水溶解定容,配制成浓度为1mg/mL的标准储备液, 于4℃避光保存,有效期3个月。 4.20 维生素B6(吡哆素、吡哆醛)混合标准中间液1(100μg/mL)、混合标准中间液2(10μg/mL):分 别准确吸取维生素B6标准贮备液(4.19)5mL、0.5mL至50mL容量瓶中,用水溶解、定容,混匀。 4.21 维生素B6(吡哆素、吡哆醛)混合标准系列工作液:分别准确吸取维生素B6混合标准中间液2(4.20) 0.1mL、1.0mL,混合标准中间液1(4.20)1.0mL、5.0mL、10.0mL、20.0mL至100mL容量瓶中,用水 溶解定容。该标准系列浓度分别为0.01μg/mL、0.1μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、 20.0μg/mL。临用前配制。 4.22 微孔滤膜:0.45μm,有机相。 5 仪器和设备 5.1 高效液相色谱(HPLC)仪:配有荧光检测器。 5.2 分析天平:感量为0.0001g和0.01g。 5.3 涡旋混合器。 5.4 水浴振荡器。 5.5 pH计。 5.6 具塞塑料离心管:50mL。 6 分析步骤 6.1 试样处理 6.1.1 试样标签中标注含吡哆醛5-磷酸酯的试样 称取1.0g混合均匀试样(精确至0.0001g)置于50mL具塞塑料离心管(5.6)中,加入1.0mL碱 性磷酸酶溶液(4.17)、用磷酸氢二钠溶液(4.16)定容至10.0mL,用涡旋混合器(5.3)充分混匀,置于水 浴振荡器(5.4)上,于(37±1)℃振荡酶解12h以上。 6.1.2 试样标签中标注含吡哆素、盐酸吡哆素及吡哆素脂肪酸酯的试样 称取1.0g混合均匀试样(精确至0.0001g)置于50mL具塞塑料离心管(5.6)中,加入10.0mL 2GB/T33309—2016 水,用涡旋混合器(5.3)充分混匀。 6.2 待测液的制备 于上述处理的试样溶液(6.1.1或6.1.2)中加入20.0mL乙醇,充分混匀后加入1.0mL氢氧化钾溶 液(4.10)混匀,置于水浴振荡器(5.4)上,于45℃±2℃避光振荡皂化45min。皂化完成后,取出冷却 至室温,加入1.05mL盐酸(4.9),用盐酸溶液(4.13)或氢氧化钠溶液(4.14)调节试样pH值至7.0,将试 样转移至50.0mL容量瓶中,用水定容至50.0mL(V1),混匀,静置。准确移取5.0mL(V2)上层清液 于25.0mL容量瓶中,用水定容至25.0mL(V3),混匀,上清液过微孔滤膜(4.22)后,供HPLC测定。 6.3 测定 6.3.1 参考条件 高效液相色谱参考条件如下: a) 色谱柱:C18柱,250mm×4.6mm(i.d.),5μm,或相当者。 b)流动相:溶剂A:甲醇,溶剂B:离子对试剂缓冲溶液(4.15)。 c)流速:1.0mL/min。 d)检测波长:激发波长293nm,发射波长395nm。 e)柱温:35℃。 f)进样量:10μL。 g)梯度洗脱条件见表1。 表1 液相色谱梯度洗脱条件 时间/min A/% B/% 0 10 90 12.0 10 90 15.0 25 75 25.0 25 75 26.0 10 90 35.0 10 90 6.3.2 标准工作曲线绘制 系列标准工作液(4.21)按色谱条件(6.3.1)进行测定,以色谱峰的峰面积为纵坐标,对应的溶液浓度 为横坐标作图,绘制标准工作曲线。吡哆醛、吡哆素标准样品色谱图参见附录B。 6.3.3 试样测定 试样溶液(6.2)按色谱条件(6.3.1)进行测定,记录色谱峰的保留时间和峰面积,由色谱峰的峰面积 从标准曲线上求出相应的吡哆醛、吡哆素的浓度。样品溶液中被测物的响应值均应在仪器测定的线性 范围内,超过线性范围的应稀释后再进样分析。 6.4 空白试验 除不称取样品外,均按上述测定条件和步骤进行。 3GB/T33309—2016 7 结果计算 试样中吡哆醛或吡哆素的含量按式(1)计算: Xi=ci×V1×V3×1000 m×V2×1000…………………………(1) 式中: Xi———试样中被测组分的含量,单位为毫克每千克(mg/kg); ci———从标准曲线上得到的待测液中维生素B6各组分的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL); V1———样品提取液总体积,单位为毫升(mL); V2———稀释用样品体积,单位为毫升(mL); V3———稀释液体积,单位为毫升(mL); m———试样质量,单位为克(g)。 计算结果需扣除空白值,保留至小数点后一位。 注:试样中盐酸吡哆素及吡哆素脂肪酸酯以吡哆素计,吡哆醛5-磷酸酯以吡哆醛计。 8 回收率 吡哆素和吡哆醛分别在添加浓度1.2mg/kg~20000mg/kg和2.5mg/kg~20000mg/kg浓度范 围内,回收率在91.6%~108.1%之间,相对标准偏差小于10%。 9 允许差 在重复性条件下获