ICS65.150 CCSB51 中华人民共和国国家标准 GB/T46303—2025 螺旋藻种质资源鉴定技术规范 TechnicalspecificationforidentificationofSpirulina(Arthrospira)species 2025-10-05发布 2026-11-01实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国标准化研究院提出并归口。 本文件起草单位:中国科学院烟台海岸带研究所、烟台市科技创新促进中心、山东省农业科学院、 中国石油大学(华东)、中国标准化研究院、福清市新大泽螺旋藻有限公司、中国科学院过程工程研究所、 内蒙古再回首生物工程有限公司。 本文件主要起草人:秦松、陈军、陈高、葛保胜、王寅初、崔玉琳、马爱进、王康、肖玉朋、黄永东、苏勇宁、 王秀峰、赵琳。 ⅠGB/T46303—2025 螺旋藻种质资源鉴定技术规范 1 范围 本文件规定了螺旋藻种质资源鉴定内容、结果鉴定的要求,描述了相应的鉴定方法。 本文件适用于钝顶螺旋藻(Limnospira/Arthrospira/Spirulinaplatensis)和极大螺旋藻(Limno- spira/Arthrospira/Spirulinamaxima)种质资源鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T34796 水溶液中核酸的浓度和纯度检测 紫外分光光度法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 鉴定内容 鉴定内容应符合表1的规定。 表1 螺旋藻基本性状与种质资源鉴定项目 性状 鉴定项目 形态学特征 藻丝直径、螺旋距离、螺旋幅度、细胞横壁收缢情况、末端细胞形状、有无气囊 分子生物学特征核糖体16S亚基编码序列(16SrDNA)、数目可变串联重复序列(VNTR) 5 试剂或材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂。 5.1 试剂 5.1.1 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB,C19H42BrN),CAS:57-09-0。 5.1.2 三氯甲烷(CHCl3),CAS:67-66-3。 5.1.3 异戊醇(C5H12O),CAS:123-51-3。 5.1.4 异丙醇(C3H8O),CAS:67-63-0。 5.1.5 苯酚(C6H6O),CAS:108-95-2。 5.1.6 乙醇(C2H6O),CAS:64-17-5。 1GB/T46303—2025 5.1.7 溴酚蓝(C19H10Br4O5S),CAS:115-39-9。 5.1.8 乙二胺四乙酸(EDTA,C10H16N2O8),CAS:60-00-4。 5.1.9 三羟甲基氨基甲烷(Tris,C4H11NO3),CAS:77-86-1。 5.2 溶液配制 5.2.1 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)缓冲液配制 称取4gCTAB和16.364gNaCl,使用70mL去离子水溶解,加入20mL1mol/L三羟甲基氨基 甲烷-盐酸(pH8.0)和8mL0.5mol/L乙二胺四乙酸,并定容至200mL。使用前需加入2%巯基乙醇 并置于65℃水浴锅中预热。 5.2.2 三氯甲烷∶异戊醇(24∶1)配制 分别量取240mL三氯甲烷与10mL异戊醇,混合均匀后置于4℃保存。 5.2.3 酚∶三氯甲烷∶异戊醇(25∶24∶1)配制 将液化苯酚置于68℃溶解,加入羟基喹啉至终浓度为0.1%。加入等体积的0.5mol/LTrisHCl (pH8.0),待两相分开后,小心移出上层水相液。加入等体积的0.1mol/LTrisHCl(pH8.0),充分混 匀后充分移出上层水相液。重复抽提,直至酚相pH大于7.8。将平衡酚、三氯甲烷和异戊醇按体积比 25∶24∶1混合,置于4℃避光条件下保存。 5.2.4 Tris-EDTA(TE)缓冲液配制 分别量取5mL1mol/LTris-HCl(pH8.0)和1mL0.5mol/LEDTA(pH8.0),加入400mL去离 子水,充分混匀后定容至500mL。高温高压灭菌,室温保存。 5.2.5 RNA酶A(RNaseA)母液配制 称取100mgRNaseA粉末,溶于10mmol/LTrisHCl(pH7.5)和15mmol/LNaCl中,定容至 10mL,于100℃加热15min,缓慢冷却至室温,分装后置于-20℃保存。 5.2.6 蛋白酶K母液配制 称取200mg的蛋白酶K粉末,溶于无菌去离子水中,轻轻摇动,直至完全溶解,加水定容到 10mL,分装后置于-20℃保存。 6 仪器设备 6.1 分析天平:精确度0.001g。 6.2 高压蒸汽灭菌锅:0.1MPa,121℃。 6.3 光学显微镜:10倍目镜,20倍~40倍物镜。 6.4 高速冷冻离心机:12000r/min,4℃。 6.5 恒温水浴锅:室温(RT)~100℃±1℃。 6.6 电泳仪:120V,45min。 6.7 凝胶成像仪:检测波长302nm。 6.8 紫外-可见光分光光度计:波长范围190nm~1100nm。 2GB/T46303—2025 7 鉴定方法 7.1 样本采集 应采集培养成熟、健康状态下的新鲜螺旋藻。 7.2 分离纯化 7.2.1 微吸管分离法 扎鲁克(Zarrouk)液体培养基配方见附录A。用培养基稀释检测样品至适宜微吸管吸取单丝浓 度,用微吸管吸取待分离样品,以小水滴置于已消毒的载玻片上4滴~5滴。显微镜/肉眼观察下,用干 净的微吸管吸取单个藻丝体置于事先准备好的Zarrouk液体培养基中进行培养。 7.2.2 平板分离法 按照附录A的培养基配方配置Zarrouk液体和固体培养基。用Zarrouk液体培养基稀释检测样品 至适宜固体平板分离单丝浓度,取金属接种环经灼烧灭菌冷却后,无菌条件下蘸取待分离样品在 Zarrouk固体培养基上轻轻做平行划线或连续划线。然后在无菌适宜条件下培养至在固体培养基上生 长出相互隔离的藻类群落。用解剖针取藻落放入已灭菌的Zarrouk液体培养基中进行培养,镜检无其 他生物混杂即达到分离目的。 7.3 单种培养 将分离纯化出来的单藻丝或其藻落进行富集培养,使藻细胞增殖到后续鉴定所需藻体浓度。 7.4 形态学鉴定 取适量培养的藻液滴在载玻片上,加上盖玻片,在显微镜下镜检观察并记录是否满足藻丝形态 特征。 7.5 分子鉴定 7.5.1 DNA提取步骤 螺旋藻基因组DNA提取步骤如下: a) 取0.5g新鲜藻体或藻粉,用蒸馏水洗涤3遍,液氮研磨后分别转入含有5倍于藻体沉淀体积 的CTAB缓冲液的离心管中; b) 65℃温浴2h,期间每10min颠倒混匀2次~3次; c) 2000r/min离心10min,取上清液转移到另一离心管中; d) 冷却至室温后,加入等体积的三氯甲烷∶异戊醇(24∶1),轻轻颠倒混匀,重复3次; e) 12000r/min离心10min,取上清液; f) 加入等体积的-20℃预冷异丙醇,轻轻颠倒混匀,于-20℃冰箱放置1h; g) 12000r/min离心10min,取沉淀部分; h) 用1mL70%乙醇,洗两次,再用无水乙醇洗一次; i) 倒去乙醇,将DNA沉淀在超净工作台内吹干; j) 加入100μLTE缓冲液,完全溶解后,再加入5μLRNaseA(10mg/mL)至终浓度 50μg/mL,37℃温浴1h; k) 加入等体积的酚∶三氯甲烷∶异戊醇(25∶24∶1),颠倒混匀,12000r/min离心10min,取上 3GB/T46303—2025 清液至另一离心管中; l) 重复步骤k); m) 加蛋白酶K至200μg/mL,37℃温浴1h; n) 重复步骤k)和l); o)加2倍体积的无水乙醇、1/2体积的NaCl,混匀后在-20℃放置1h; p)重复步骤g)~i),加100μLTE缓冲液,室温下放置1h~2h,直至完全溶解; q)所提DNA浓度及纯度测定按GB/T34796的规定执行; r)将DNA溶液用TE缓冲液稀释至100ng/μL的浓度,置于-20℃的冰箱中保存备用。 7.5.2 16SrDNA鉴定 7.5.2.1 聚合酶链式反应(PCR)扩增 以所提取的螺旋藻基因组DNA为模板,使用符合附录B要求的16SrDNA引物,以钝顶和极大螺 旋藻标准株基因组DNA为阳性对照,以TE缓冲液为阴性对照,进行PCR扩增。PCR扩增反应体系 为25μL,含2.5μL10×PCR缓冲液,10ng模板DNA,2.5mmol/LMg2+,1.5UTaq酶,200nmol/L 引物,200μmol/LdNTP,最后添加去离子水至总体积为25μL。然后94℃预变性5min,94℃变性 30s,60℃复性30s,72℃延伸1min,35个循环后,72℃延伸10min。 7.5.2.2 测序分析 使用DNA片段胶回收试剂盒回收并纯化目的片段。将回收的目的片段同T载体进行连接,使目 的片段和载体的摩尔比为5∶1,然后通过热激转化法进行细菌转化。挑去转化后的单克隆进行培 养,用质粒纯化试剂盒从细菌克隆中提取和纯化质粒DNA。纯化后的质粒DNA在DNA测序仪上采 用桑格(Sanger)双脱氧链终止法原理在进行测序分析。 7.5.3 数目可变串联重复序列(VNTR)鉴定 7.5.3.1