ICS 65.020.20 B 05 团体标 准 T/FSSJ SYNY001—2020 代替T/FSSJ SYNY001 -2017 黑木耳液体菌种生产技术规程 Production Technical Practice for Liquid Spawn of Auric ularia auricula 2020 - 01 - 20发布 2020 - 01 - 20实施 辽宁省食用菌协会 发布 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/FSSJ SYNY001—2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 －2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由辽宁省食用菌协会提出。 本标准由辽宁省食用菌协会 归口。 本标准起草单位： 辽宁三友农业生物科技有限公司、 辽宁省微生物科学研究院、 辽宁省食用菌协会。 本标准主要起草人：邹存兵、赵铠、朱巍巍、张忠伟、陈飞、黄云松、李莹莹、孙凯、 刘东旭、刘 芳岑、盛金、王俊超。 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/FSSJ SYNY001—2020 1 黑木耳液体菌种生产技术规程 1 范围 本标准规定了黑木耳液体菌种生产的基本要求，主要包括生产场地、厂房和布局、设施设备、生产 工艺流程、质量要求、技术要求、生产记录与存档、菌种贮藏。 本标准适用于黑木耳液体菌种的生产。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版 本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19169 黑木耳菌 种 GB/T 12728 食用菌术语 GB/T 150.4 压力容器 第4部分：制造、检验和验收 NY/T 1742 食用菌菌种通用技术要求 NY/T 1731 食用菌菌种良好作业规范 NY/T 528 食用菌菌种生产技术规程 NY/T 1846 食用菌菌种检验规程 3 术语和定义 GB/T 12728 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 发酵罐 fermentation bior eactor 进行发酵培养的专用设备，也称发酵反应器。 3.2 罐压 pressure of fermentation bioreactor 指液体菌种培养过程中培养器内保持的空气压力，单位： Mpa。 3.3 通风量 ventilation volume 液体菌种培养时每分钟通入培养基中的无菌空气的量。用 V/V（培养基体积 /通入空气体积）标示。 3.4 接种量 inoculation quantity 接入培养器中的菌种的数量，以菌种体积与培养基体积的百分比标示。 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/FSSJ SYNY001—2020 2 3.5 摇瓶液体种 flask culture 装在玻璃三角瓶内于 摇床上恒温振荡培养的液体菌种。 3.6 初始pH值 initial pH 液体培养基配制灭菌后未接种时的 pH值。 4 人员 应有与液体菌种生产所需的专业技术人员，包括检验人员 。 5 场地和设施 5.1 生产场地、厂房和 布局 通风良好，交通便利。周围无工矿企业污染源、生活垃圾堆放和填埋场、工业固体废弃物和危险废 弃物堆放和填埋场等。 布局符合 符合NY/T 528 规定。 5.2 生产设施与设备 根据生产需求进行配备， 使用符合NY/T 1731设备管理 规定。压力容器应符合 GB/T 150.4 规定并经 政府有关部门检验合格。 6 生产工艺流程 母种→摇瓶液体种 ↓ 培养料配制→ 投料→灭菌→冷却→接种→培养→ 发酵罐液体种 7 培养基 母种培养基使用附录 A中A.1规定的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ PDA）或A.2规定的综合马铃薯葡萄糖 琼脂培养基（ CPDA）。 液体种培养基根据 黑木耳品种及当地原料的要求使用适宜配方（见附录 B），严格掌握初始 pH。 8 母种 母种继代培养后须按 NY/T 1846 规定抽样，并进行感官检验和菌丝微观特征检验，合格菌种进入生 产流程。母种质量要求符合 GB 19169 及NY/T 1742 关于母种 质量的规定。 9 摇瓶液体 菌种生产 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/FSSJ SYNY001—2020 3 9.1 培养基分装及灭菌 摇瓶液体种培养基装量 为容器体积的 1/4至1/3， 分装后立即灭菌。 按常规高压蒸汽灭菌锅操作规程， 0.1Mpa～0.12Mpa（121℃～126℃），维持 25min。 灭菌后的摇瓶液体种培养基于 30℃±1℃ 培养箱恒温培养 48小时后，观察确认无混浊、无异味，可 用于接种 培养。 9.2 接种 按无菌操作 规程，将母种斜面菌丝体切割成 2mm～4mm颗粒，移入摇瓶培养基中，每 100 mL液体培养 基接种菌丝体颗粒 1颗～3颗。 9.3 培养 菌种培养温度 26℃±1℃，空气相对湿度 55%～65%，避光振荡培养。往复式摇床振荡频率 60次～120 次/分， 旋转式摇床振荡频率 150转～180转/分。每日检查生长状态，及时检出浑浊、异味、泡沫异常 的不合格菌种。 摇瓶静置 1分钟后，菌丝球体积占比液体培养基体积的 4/5以上，可结束培养。 10 发酵罐液体菌种生产 10.1 空气过滤系统检查 使用前要拆分检查滤芯，要求无油污、料污、无破损，外壳内外壁要求无污物、光亮洁净。 滤芯在额定风量下，对粒径 0.1～0.2μm粒子的过滤效率大于 99.99%，空气阻力低于 280pa。 10.2 发酵罐检查与清洗 检查罐上全部阀门、安全阀、压力表、要求完好，工作正常。对罐体内、外和全部阀门用流水进行 冲洗，达到无死角、内壁无任何培养料残余物的洁净程度。 10.3 空消灭菌 发酵罐初次使用、出现染菌、长期放置 及更换品种时， 应进行空消灭菌。有内置电加热棒的培养器 加水至容积的 80%加热至121℃，维持 40min。用外源蒸汽灭菌的培养器，蒸汽压力达到 0.1Mpa～0.12Mpa （121℃～124℃），维持 40min。 10.4 投料定容 将配制好的培养基材料搅拌均匀，倒入或用泵抽入发酵罐中，加水定容至所需体积。培养基投料总 量为罐体总 容积的70%～80%。 10.5 灭菌和冷却 按高压蒸汽灭菌方法操作，培养器内压力达到 0.1Mpa～0.12Mpa，培养基温度达到 121℃～124℃、 保持时间 60 min～90 min。 灭菌结束将培养基降温至 24℃～28℃。 降温过程中要及时向培养器内补充过滤空气， 防止罐压回零。 10.6 接种 利用火焰保护接种，接种量为罐内培养基总量的 0.1%～0.5%。 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/FSSJ SYNY001—2020 4 10.7 培养 发酵罐通风量每分钟 1：0.5～1.2 V／V(料液体积／空气体积 )，调节罐压保持在 0.02 Mpa ～0.04 Mpa，培养温度调节在 24℃～26℃，培养7d～10d可达到香菇液体菌种成品标准。特殊品种根据特殊需求 具体设定。 10.8 检测和判定 培养开始3d后每日从发酵罐中取出样品进行检测。 按照NY/T 1846 中菌丝微观特征、细菌霉菌检验 方法检验，如异常则排空罐内培养物，空消，重新生产。 发酵终 pH 4.5-5.5，每100ml液体菌种菌丝干离心后重量 2.0～2.8g/100ml。合格黑木耳液体菌种 球状菌丝体呈白色，滤液呈淡黄色。菌液稍粘稠，有大量球状菌丝体悬浮、分布均匀、菌球浓白清晰， 有黑木耳液体菌种培养时特有的香气，无异味。 10.9 贮藏 成品液体菌种 应及时应用 。 特殊情况下 ，培养结束后在发酵罐 内通入无菌空气，保持罐压 0.02Mpa～0.04Mpa，环境温度 6℃～ 10℃，可保存24h。 11 记录与存档 灭菌、培养 、检测环节应有记录，由具体操作人员现场填写，定期审核，签字后归档保存。 12 标签、包装、运输、贮存 符合NY/T528关于标签标志、包装运输 、贮存条件 的要求。 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/FSSJ SYNY001—2020 5 A A 附 录 A （规范性附录） 母种常用培养基及配方 A.1 PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基） 马铃薯200g（用浸出汁），葡萄糖 20g，琼脂20g，水1000 ML，pH6.5～7.0。 A.2 CPDA 培养基（综合马铃 薯葡萄糖琼脂培养基） 马铃薯200g（用浸出汁） ， 葡萄糖 20g， 磷酸二氢钾 2g，硫酸镁0.5g，VB1 100mg ，水1000 ML，pH6.5～ 7.0。 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/FSSJ SYNY001—2020 6 B B 附 录 B （规范性附录） 黑木耳液体种常用培养基及配方 B.1 马铃薯葡萄糖培养基 马铃薯全粉 400g（100目） ，葡萄糖 2000g，磷酸二氢钾 100g，硫酸镁 50