T/CAFFCI XXXX-XXXXT /CAFFCI XXXX-XXXXT /CAFFCI XXXX-XXXXT/GZTPA 团体标准 T/GZTPA0003-2019 茶叶、茶青中赤霉酸残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法 Determinationofgibberellinacidresidueinteaandtealeaves Liquidchromatographytandemmassspectrometry 2019-12-26发布 2020-01-01实施 贵州省绿茶品牌发展促进会发布 全国团体标准信息平台 T/GZTPA0003-2019 I前  言 本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由北京勤邦生物科技有限公司提出。 本标准由贵州省绿茶品牌发展促进会归口。 本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、北京勤邦生物科技有限公司。 本标准主要起草人：金芬、王静、邵华、金茂俊、佘永新、郑鹭飞、王珊珊、张鹏、李春梅、冯才 伟、崔海峰。 全国团体标准信息平台 T/GZTPA0003-2019 1茶叶、茶青中赤霉酸残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法 1范围 本标准规定了茶叶、茶青中赤霉酸残留量液相色谱-质谱/质谱的测定方法。 本标准适用于贵州省绿茶品牌发展促进会会员生产的茶叶、茶青中赤霉酸残留例行监测和风险评估 时使用。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T8302茶取样 3原理 试样中残留的赤霉酸采用乙腈-乙酸溶液提取，固相萃取柱净化，用液相色谱-质谱/质谱测定，外标 法定量。 4试剂与材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水为符合GB/T6682中规定的一级水。 4.1试剂 4.1.1乙腈（CH3CN）：色谱纯。 4.1.2甲醇（CH3OH）：色谱纯。 4.1.3乙酸（CH3COOH）：色谱纯。 4.1.4乙酸铵（CH3COONH4）：色谱纯。 4.1.5无水硫酸镁（MgSO4）：分析纯 4.1.6氯化钠（NaCl）：分析纯。 4.2溶液配制 4.2.10.5%乙酸-乙腈：吸取5mL乙酸，加入乙腈定容至1000mL，混匀。 4.2.25mM乙酸铵溶液（含0.5%乙酸）：准确称取192.7mg乙酸铵于500mL容量瓶中，用少量水溶解 后加入2.5mL乙酸，再用水定容至刻度，混匀，现用现配。 4.2.35mM乙酸铵-甲醇溶液（含0.5%乙酸）：准确称取192.7mg乙酸铵于500mL容量瓶中，用少量 甲醇溶解后加入2.5mL乙酸，再用甲醇定容至刻度，混匀，现用现配。 4.3标准品 全国团体标准信息平台 T/GZTPA0003-2019 2赤霉酸标准品（gibberellicacid,GA3,CAS号为77-06-5，分子式为C19H22O6）：纯度≥98%。 4.4标准溶液配制 4.4.1赤霉酸标准储备溶液：称取100mg（精确至0.01mg）赤霉酸标准品，用甲醇溶解并定容于50mL 容量瓶中，溶液浓度为2mg/mL。0~4℃冷藏避光保存。有效期三个月。 4.4.2标准工作溶液：根据需要用空白样品提取液将标准储备液稀释成10、20、50、100、200、500ng/mL 的标准工作溶液，临用前配制。 4.5材料 4.5.1石墨化碳黑固相萃取柱或相当：500mg，6mL。 4.5.2有机相微孔滤膜：0.22μm。 5仪器和设备 5.1液相色谱-质谱/质谱仪：配有电喷雾离子源。 5.2分析天平：感量1mg和0.01mg。 5.3涡旋混合器。 5.4粉碎机。 5.5氮吹浓缩仪。 5.6离心机：最大转速10000r/min。 6分析步骤 6.1试样制备与保存 6.1.1试样制备 按GB/T8302抽取茶叶、茶青样品，将样品粉碎，混匀，密封，作为试样。 6.1.2试样保存 将茶叶试样保存在-4℃，将茶青试样于-18℃以下冷冻保存。 在抽样和制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。 6.2提取 6.2.1茶叶样品 称取2g试样（精确至1mg）于50mL具塞塑料离心管中，加入10mL水和10mL0.5%乙酸-乙腈 提取溶剂，涡旋1min，以10000r/min离心5min。静置片刻，上清液移取到另一50mL具塞塑料离心 管中。残渣再加入10mL提取溶剂提取一次，合并两次上清液。在上清液中再加入1g氯化钠和2g无 水硫酸镁，涡旋1min，以10000r/min离心5min，上清液待净化。 6.2.2茶青样品 全国团体标准信息平台 T/GZTPA0003-2019 3称取5g试样（精确至1mg）于50mL具塞塑料离心管中，加入10mL0.5%乙酸-乙腈提取溶剂， 其余提取步骤同6.2.1。 6.3净化 用5mL乙腈预淋洗石墨化碳黑固相萃取柱，弃去流出液。将1mL待净化的上清液加入石墨化碳 黑固相萃取柱中，待提取液全部流出后，再用5mL乙腈洗脱萃取柱，重力洗脱，收集全部洗脱液，40℃ 下氮吹至近干，用1mL甲醇复溶，过0.22μm滤膜，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。 6.4测定 6.4.1液相色谱-质谱/质谱 液相色谱-质谱/质谱参考条件如下： a)色谱柱：C18液相色谱柱，5µm，2.1mm×150mm或相当； b)流动相：5mM乙酸铵溶液（含0.5%乙酸）-5mM乙酸铵-甲醇溶液（含0.5%乙酸），梯度 洗脱程序参见表1； 表1梯度洗脱程序表 c)柱温：40℃； d)流速：0.2mL/min； e)进样量：5µL。 f)离子源：电喷雾离子源； g)扫描方式：负离子扫描； h)检测方式：多反应监测； i)雾化气、气帘气及辅助气均为高纯氮气或其他合适气体；使用前应调解各气体流量以及离子源 温度（TEM）使质谱灵敏度达到检测要求，参考条件参见附录A； j)电喷雾电压（ESI）、碰撞电压（CE）、去簇电压（DP）、碰撞室入口电压（EP）、碰撞室出口 电压（CXP）应优化至最佳灵敏度，监测离子和定量离子等详细条件参见附录A中表A.1。 6.4.2液相色谱-质谱/质谱测定 根据样液中被测物的含量情况，选定响应值适宜的标准工作溶液进行色谱分析，标准工作液应有六时间（min）5mM/L乙酸铵-0.5%乙酸 水溶液（流动相A）5mM/L乙酸铵-0.5%乙酸 甲醇溶液（流动相B） 0 85 15 2 85 15 6 40 60 8 40 60 9 85 15 15 85 15 全国团体标准信息平台 T/GZTPA0003-2019 4个浓度水平。待测样液中赤霉酸的响应值均应在仪器检测的工作曲线范围内。在上述色谱条件下，赤霉 酸的参考保留时间约为9.6min。标准溶液的选择性离子流图参见附录B中图B.1。 6.4.3液相色谱-质谱/质谱确证 按照上述条件测定样品和标准工作液，如果检测的质量色谱峰保留时间与标准工作液一致，允许偏 差小于±2.5%；定性离子对的相对丰度与浓度相当标准工作液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超 过表2的规定，则可判断样品中存在目标化合物。 表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对丰度（基峰） ≥50% >20%至50% >10%至20% ≤10% 允许的相对偏差 ±20% ±25% ±30% ±50% 6.5空白试验 空白试验不加试样，均按上述步骤进行操作。 7结果计算和表述 用色谱数据处理机或按式（1）计算试样中赤霉酸残留含量，计算结果需扣除空白值。 X=䳌䳌䳌 䳌䳌䳌 式中： X——试样中赤霉酸的残留量，单位为微克每千克（μg/kg）； Ci——从标准曲线上得到的赤霉酸浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； V——样液最终定容体积，单位为毫升（mL）； m——称样量，单位为克（g）。 n——稀释倍数。 8精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。 9定量限和回收率 9.1定量限 本方法的定量限：茶叶80µg/kg，茶青8µg/kg。 9.2回收率 不同基质中添加浓度水平下的回收率范围参见附录C。 全国团体标准信息平台 T/GZTPA0003-2019 5附录A （资料性附录） 监测离子对及电压参数： a)电喷雾电压(ESI)：-4500V； b)雾化气压力(GS1)：40Psi； c)气帘气压力(CUR)：5Psi； d)辅助气流速(GS2)：40Psi； e)离子源温度(TEM)：450C； f)离子对、碰撞电压（CE）、去簇电压（DP）、碰撞室入口电压（EP）、碰撞室出口电压（CXP）见 表A.1。 表A.1离子对、CE、DP、EP、CXP参数表 化合物 母离子m/z子离子m/z CE(V) DP(V) EP(V) CXP(V) 赤霉酸 -345.2-143.1a-40 -90 -10 -15 -221.2 -30 -90 -10 -15 a定量离子 全国团体标准信息平台 T/GZTPA0003-2019 6附录B （资料性附录） 赤霉酸标准品选择性离子流图 345.2/143.1 图B.1赤霉酸（0.2mg/L）标准品的选择性离子流图 全国团体标准信息平台 T/GZTPA0003-2019 7附录C （资料性附录） 样品的添加浓度及回收率的实验数据 表C.1样品的添加浓度及回收率的实验数据