ICS71.100.01 分类号:Y40T/GDCDC 广东省日化商会团体标准 T/GDCDC010-2019 化妆品防腐挑战性测试方法 Testmethodforthepreservativechallengeofcosmetics 2019-12-16发布 2020-01-01实施 广东省日化商会 发布 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/GDCDC010-2019 I前  言 本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分:标准的结构和编写规则》起草。 请注意本标准的某些内容可能涉及专利，本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由广东省日化商会提出和归口。 本标准起草单位:上海新高姿化妆品有限公司、广州中科检测技术服务有限公司、广州薇美姿实业 有限公司、广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）、广东雅丽洁精细化工有限公司、广东 博然堂生物科技有限公司、广东嘉丹婷日用品有限公司、广州市娇兰化妆品有限公司、广东芭薇生物科 技股份有限公司、广东润洁日化有限公司、广东迪美生物技术有限公司、南京华狮新材料有限公司、拉 芳家化股份有限公司、广东省日化商会。 本标准主要起草人:李雪竹、唐嘉雯、钟瑜、陈敏珊、孙廷丽、郑木创、张梅、王耀、曾小云、张 娇、张忠伟、刘永龙、任传鹏、周生、刘丽红、卓琦。 本标准于2019年12月首次发布。 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/GDCDC010-2019 1化妆品防腐挑战性测试方法 1范围 本标准规定了化妆品的防腐效果测试方法，包括术语和定义、仪器及设备、培养基和试剂、生物菌 株、实验步骤和结果计数及报告方法。 本标准适用于亲水性的膏、霜、乳、水剂等常见化妆品的防腐效果测试。 2术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 防腐 采用化学或物理方法预防或抑制产品内微生物生长的过程。 2.2 防腐挑战性测试 在产品中接入若干种类，一定数量的微生物并定期检测样品中微生物的数量，根据数量的变化来评 价其防腐效果。 3仪器及设备 测试所需仪器及设备如下： a)生物安全柜； b)高压蒸汽灭菌锅； c)冰箱：2℃-8℃； d)培养箱：36℃±1℃、28℃±2℃； e)恒温水浴锅； f)振荡器； g)天平：精确至0.01g； h)pH计； i)移液器：容量1mL、5mL和10mL； j)灭菌试管：15×150mm； k)灭菌培养皿：直径90mm； l)锥形瓶：容量250mL； m)玻璃珠； n)玻璃棒； o)均质器； 全国团体标准信息平台 T/GDCDC010-2019 2p)离心机。 4培养基和试剂 4.1卵磷脂-吐温80营养琼脂培养基 4.1.1成分 蛋白胨 20g 牛肉膏 3.0g 氯化钠 5.0g 琼脂 15.0g 卵磷脂 1.0g 吐温80 7.0g 蒸馏水 1000mL 4.1.2制法 先将卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入吐温80，将其他成分加到其余的蒸馏水中，溶解。 加入已溶解的卵磷脂、吐温80，混匀，用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调节pH值至7.1-7.4， 分装，于121℃高压灭菌20分钟。 4.2沙氏琼脂培养基 4.2.1成分 蛋白胨 10.0g 葡萄糖 40.0g 琼脂 15.0g 氯霉素 0.1g 蒸馏水 1000mL 4.2.2制法 取上述成分混合，溶解，分装，于115℃高压灭菌15分钟。 4.3卵磷脂-吐温80沙氏琼脂培养基 4.3.1成分 蛋白胨 10.0g 葡萄糖 40.0g 琼脂 15.0g 氯霉素 0.1g 卵磷脂 1.0g 吐温807.0g 蒸馏水 1000mL 4.3.2制法 全国团体标准信息平台 T/GDCDC010-2019 3取卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入吐温80；取除卵磷脂和吐温80外其他成分加到剩余的 蒸馏水中，溶解，再加入已溶解的卵磷脂、吐温80，混匀，分装，于115℃高压灭菌15分钟。 4.4营养琼脂 4.4.1成分 蛋白胨 10.0g 牛肉膏粉3.0g 氯化钠 5.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 1000mL 4.4.2制法 取上述成分混合，溶解，用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调节pH值至7.3±0.2，分装，于 121℃高压灭菌15分钟。 4.5生理盐水 称取氯化钠8.5g，蒸馏水加至1000mL，溶解，分装，于121℃高压灭菌20分钟。 4.60.5%氯化三苯四氮唑（TTC） 称取氯化三苯四氮唑粉末0.5g，加100mL蒸馏水溶解，过滤除菌或于115℃高压灭菌20分钟，装于棕 色试剂瓶，置4℃冰箱备用。 5生物菌株 菌株代数均不超过5代，可根据需求增加其他菌株作为实验菌株。可以使用加入世界菌种保藏联合 会的菌种保藏机构提供的、与下述菌种等效的试验菌。 5.1细菌 金黄色葡萄球菌ATCC6538，大肠杆菌ATCC8739，铜绿假单胞菌ATCC9027。 5.2真菌 白色假丝酵母ATCC10231，巴西曲霉ATCC16404。 6实验步骤 6.1样品的背景微生物检查 6.1.1从不少于2个包装单位的产品中共取10g或10mL，加入到装有玻璃珠的90mL灭菌生理盐水锥 形瓶中，振荡20秒，或加入到装有90mL灭菌生理盐水的灭菌均质袋中，使用均质器拍打均质1-2分钟， 混合后，制成1:10稀释液。 6.1.2吸取稀释液4mL，分别注入到四个灭菌平皿内，每皿1mL。将45℃-50℃卵磷脂-吐温80营养琼 脂培养基（每100mL卵磷脂-吐温80营养琼脂中加入1mL0.5%TTC溶液）倾注到其中两个平皿内，另 外两个平皿中倾注卵磷脂-吐温80沙氏琼脂培养基，每皿约15mL，随即转动平皿，使样品与培养基充 全国团体标准信息平台 T/GDCDC010-2019 4分混匀，待琼脂凝固后翻转平皿。 6.1.3细菌培养条件：36℃±1℃，48小时±2小时，然后做菌落计数；真菌培养条件：28℃±2℃，5 天，并于第3天起逐日1)观察计数，以菌落未蔓延生长的最大天数结果报告。 6.22)菌液制备 6.2.1混合细菌悬液制备 6.2.1.1将待测细菌分别接种到营养琼脂斜面上，于36℃±1℃培养18小时-24小时。 6.2.1.2将5mL-10mL的生理盐水加入斜面试管内，反复吹吸洗下菌苔。 6.2.1.3分别用移液器将每种菌悬液移至相应的无菌试管中，振荡20秒，混匀后，稀释至实验所需浓 度1×108CFU/mL-9×108CFU/mL。 6.2.1.4将每种细菌菌液稀释液按等体积混合，菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若 保存在2℃-8℃，可在24小时内使用。 6.2.1.5取上述菌液1mL加入到9mL生理盐水试管中充分混匀，制成1:10稀释液，以此类推制成1:100， 1:1000等适宜的稀释倍数。取2-3个适宜浓度稀释度的稀释液（一般取稀释度为1:100000，1:1000000 和1:10000000的稀释液），每个稀释液取2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。 6.2.1.6将45℃-50℃营养琼脂倾注到平皿内，每皿约15mL，随即转动平皿，使样品与培养基充分混 匀，待琼脂凝固后，倒置于36℃±1℃培养箱内培养48小时±2小时，然后做菌落计数。 6.2.2混合真菌悬液制备 6.2.2.1将待测真菌分别接种到沙氏琼脂培养基斜面上（或根据菌种培养需求自定），其中，白色假 丝酵母于28℃±2℃培养24小时-48小时，巴西曲霉于28℃±2℃培养5-7天。 6.2.2.2将5mL-10mL的生理盐水加入斜面试管内，反复吹吸洗下菌苔。 6.2.2.3分别用移液器将每种菌悬液移至相应的无菌试管中，振荡20秒，混匀后，制备成实验所需浓 1×107CFU/mL-9×107CFU/mL。 6.2.2.4将每种真菌菌液按等体积混合，并使用100μm细胞过滤器或无菌纱布过滤菌丝体，也可使用 离心机离心获取孢子。菌液制备后可保存在2℃-8℃，并在验证过的贮存期内使用。 6.2.2.5吸取上述菌液1mL加入到9mL生理盐水中充分混匀，制成1:10稀释液，以此类推制成1:100， 1:1000等适宜的稀释倍数。取2-3个适宜浓度稀释度的稀释液（一般取稀释度为1:10000，1:100000， 1:1000000的稀释液），每个稀释液取2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。 6.2.2.6将45℃-50℃沙氏琼脂培养基（或根据菌种培养需求自定）倾注到平皿内，每皿约15mL，随 即转动平皿，使样品与培养基充分混匀，待琼脂凝固后，倒置于28℃±2℃培养箱内培养5天，并于第 3天起逐日观察计数，以菌落未蔓延生长的最大天数结果报告。 6.2.3单一细菌悬液制备 按6.2.1中6.2.1.1、6.2.1.2、6.2.1.3、6.2.1.5和6.2.1.6步骤操作。 6.2.4单一真菌悬液制备 按6.2.2中6.2.2.1、6.2.2.2、6.2.2.3、6.2.2.5和6.2.2.6步骤操作。 6.3待测样品加菌 6.3.1混合菌接种 1)当样品中菌落数＜100CFU/mL（g）时，方可进行防腐挑战性测试。 2)接种方式可根据需求选择混合菌接种或单一菌接种。 全国团体标准信息平台 T/GDCDC010-2019 5在无菌条件下称取样品于两个无菌试剂瓶中，每瓶100g或100mL。在称好的2瓶样品中分别加入1mL 的混合细菌菌液和1mL的混合真菌菌液。将菌液和样品充分混合均匀，置于室温（20℃-25℃）避光贮存。 6.3.2单一菌接种 3)在无菌条件下称取样品于无菌试剂瓶中，每瓶100g或100mL。在称好的